配置RPMI-1640培養基的注意事項如下：
1)配制培養基最好使用新制備的三蒸水。一般在試驗前當天或前一天制備為好。調節pH值的酸堿溶液也應該使用這種水配制。
2)培養液配好后，應先抽取少許放入培養瓶內，于37℃溫箱內置24～48hr，以檢測培養液是否有污染。
3)溶解培養基：將干粉培養基溶于總量1/3的水中，再用水洗包裝袋內面兩次，倒入培養液中。振蕩或超聲助溶，一般不要加熱助溶。
4) 補加試劑：根據包裝袋說明和試驗需要加入NaHCO3(2.0g)、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等其他試劑。
5) 加抗生素：一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml。市售青霉素為80萬U/瓶，可溶于4ml體積，每一升培養液中加0.5ml即可。市售鏈霉素為100萬U/瓶，可溶于5ml體積，每一升培養液中也加0.5ml即可。無鏈霉素的情況下，用慶大霉素代替，終濃度調為50～200U/ml。
6) 調pH值：加水到900ml(在需要加10%小牛血清的情況下)，然后用5% NaHCO3調節pH到7.2。
7) 過濾除菌：宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um，以保證過濾效果。注意濾膜正面(光面)朝上。過濾后分裝于小瓶中(100或200ml)。
8) 加小牛血清：根據培養基配制的量將小牛血清分裝，冷凍保存(-20℃)。臨用前將加入小牛血清(10%~20%)。
9)每次配液時，需要的其他輔助性液體(Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等)也可以同時配制，分別過濾。
10)市售小牛血清使用前都應該滅活(56℃，30min)，以消除補體活性。動物血清個體差異大，故而每一批血清都進行嚴格檢測，同時進行無菌試驗。優質血清應該為淡黃色，透明，無溶血，無沉淀，滅活后顏色稍深。生化檢測總蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml。選定一個效果較好的批號后，可一次多購該批號的血清，保證試驗條件的穩定。
11)由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。試驗中加入小牛血清后，培養基的pH可能還會變化，故亦可先加入小牛血清后調pH值。但此種方法過濾較困難，只適于正壓過濾。
12)每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止營養成分(主要為谷氨酰胺)損失，造成實驗繁瑣或者污染。
13)最后，制備培養基的器皿清洗要絕對干凈，烤干后備用(濾器、濾膜、量筒、移液管及盛放培養基的小瓶等存放和轉移培養基液體的器具都應進行滅菌)。
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