葡聚糖凝膠柱的預(yù)處理、裝柱、加樣、洗脫收集與回收
更新時(shí)間：2014-12-15 | 點(diǎn)擊率：6288
1、葡聚糖凝膠柱的預(yù)處理
稱取Sephadex葡聚糖凝膠（50－100目）約5g，加入蒸餾水100ml，置室溫下3h進(jìn)行溶脹。
凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲（約200目尼龍布）墊底或購(gòu)買類似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好，先加入1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們?cè)谥鶅?nèi)自然沉降。同時(shí)大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必須均勻，不能有氣泡或明顯條紋。否則，必須到出重裝，裝好后，用蒸餾水平衡2－3h即可加樣品分離。
3、葡聚糖凝膠柱的加樣
加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出，直到柱內(nèi)液面與凝膠表面相齊（或留一極薄液層）為止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完樣品后，打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量蒸餾水沖洗原來(lái)盛樣品的容器2－3次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)行洗脫。
4、葡聚糖凝膠柱的洗脫與收集
洗脫時(shí)，用蒸餾水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行，使凝膠柱上端保持一定的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。本實(shí)驗(yàn)洗脫液流出的速度應(yīng)控制在0.8－1.0ml/min。洗脫液的收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集3ml，共收集10管。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，4或5號(hào)管核苷酸濃度zui大，可作為層析鑒定的樣品液。但因?qū)游鲋L(zhǎng)度的差異，管號(hào)會(huì)有變化，必要時(shí)可用紫外檢測(cè)A260nm，找出濃度zui大的管號(hào)。
5、凝膠的再生和回收
葡聚糖凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。若使用數(shù)次，就需要再生處理。用0.1mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。若實(shí)驗(yàn)完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
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